纤毛虫是土壤、淡水、海洋及人类工农业生产环境中的重要功能类群[1]，也是生物学研究中的重要模式[2]。然而，目前纤毛虫多样性研究常采用传统的真核生物通用引物进行扩增，往往会同时扩增真菌、藻类等大量非目标序列；已有的纤毛虫特异性引物又难以兼容短片段测序，且部分建库流程较为复杂。这些因素导致测序数据中纤毛虫序列占比较低，限制了纤毛虫多样性调查的效率和准确性[3−5]。
近日，中国海洋大学进化基因组学实验室针对这一问题，建立了一套基于纤毛虫（纤毛门）特异性18S rDNA V2–V4区域的一步法靶向测序技术（图1），为纤毛虫多样性研究提供了一种高效、便捷的技术方案。
图1 纤毛虫特异性靶向测序技术流程图。
在该研究中，团队基于覆盖16个纲的112种纤毛虫18S rRNA基因序列，设计了靶向V2–V4区域的纤毛虫特异性引物，并结合团队前期开发的一步法扩增子文库制备流程，在一次常规PCR中同步完成目标序列扩增、测序接头连接和样本索引引入，无需额外的再扩增和中间纯化。最终获得的427–520 bp扩增片段可直接适配华大G99平台PE300短读长测序。
实验结果表明，在人工群落中，该引物体系对纤毛虫的扩增灵敏度达到93.75%，特异性达到100%。在土壤和养殖池塘沉积物样品中，纤毛虫序列分别占全部扩增子序列变体（ASV）的98.45%和99.07%；相比之下，采用真核生物通用引物时，纤毛虫序列占比仅为3.03%–8.71%。这表明，在相同测序深度下，该方法能够大幅降低非目标序列对测序资源的占用，从而获得更加丰富的纤毛虫多样性信息。
该方法对肾形纲（Colpodea）、寡膜纲（Oligohymenophorea）、旋毛纲（Spirotrichea）、前口纲（Prostomatea）和篮口纲（Nassophorea）等多个纤毛虫类群表现出良好的扩增效果，并显著提高了低丰度及未分类谱系的检出能力，因此也可作为上述类群的纲级靶向测序工具。对于叶口纲（Litostomatea），目前该方法的扩增效率仍有进一步优化空间。针对这一问题，研究团队已设计相应的补充引物，为进一步完善纤毛虫靶向检测体系奠定了基础。
该技术为土壤、水体和沉积物等复杂环境中的纤毛虫多样性调查提供了一种高效、简便且经济的技术工具，也为针对其他生物类群开发特异性一步法扩增子测序技术提供了参考。
目前，该技术已获国家发明专利授权，专利名称为“纤毛虫特异性引物、适用于扩增子测序技术的纤毛虫特异性长引物及试剂盒和应用”，从实质审查到获得授权仅用时2个月，并已实现技术转化和产品化（图2）。相关研究成果发表于Journal of Zoological Systematics and Evolutionary Research，论文题为“Efficient enrichment of ciliate sequences using a phylum-specific one-step amplicon approach”（利用门特异性一步法扩增子方法实现纤毛虫序列的高效富集；文章链接：https://doi.org/10.48130/jzser-0026-0012）。
图2 纤毛虫特异性18S rDNA V2–V4扩增子文库制备试剂盒。
中国海洋大学为该研究成果的第一完成单位，张俣副教授、潘娇博士为论文通讯作者，博士研究生邓子光为第一作者。上海海洋大学潘宏博、东京大学胡宫泽以及其他合作单位的科研人员、多名研究生和本科生参与了相关研究工作并作出重要贡献。该研究得到国家自然科学基金委员会、山东省泰山学者特聘专家计划等项目资助。
参考文献：
[1] Foissner W. 1998. An updated compilation of world soil ciliates (Protozoa, Ciliophora), with ecological notes, new records, and descriptions of new species. European Journal of Protistology 34:195–235
[2] Sabater S, Guasch H, Romaní A, Muñoz I. 2002. The effect of biological factors on the efficiency of river biofilms in improving water quality. Hydrobiologia 469:149–56
[3] Dunthorn M, Klier J, Bunge J, Stoeck T. 2012. Comparing the hyper‐variable V4 and V9 regions of the small subunit rDNA for assessment of ciliate environmental diversity. Journal of Eukaryotic Microbiology 59:185–87
[4] Zhao F, Filker S, Xu K, Li J, Zhou T, et al. 2019. Effects of intragenomic polymorphism in the SSU rRNA gene on estimating marine microeukaryotic diversity: A test for ciliates using single‐cell high‐throughput DNA sequencing. Limnology and Oceanography: Methods 17:533–43
[5] Fernandes NM, Campello-Nunes PH, Paiva TS, Soares CAG, Silva-Neto ID. 2021. Ciliate diversity from aquatic environments in the Brazilian Atlantic forest as revealed by high-throughput DNA sequencing. Microbial Ecology 81:630–43
