作为真核生物DNA上的一种重要表观遗传修饰，DNA N6-甲基腺嘌呤（6mA）已被证实在应激响应、胚胎发育及免疫调控等多种生物学过程中扮演关键角色。单细胞真核生物的6mA含量尤其丰富，且有明确的6mA“书写器”（AMT1甲基转移酶复合体）在ApT基序上建立和维持6mA。然而，一个长期悬而未决的问题是：单细胞真核生物中负责6mA去除的“橡皮擦”（去甲基化酶）究竟是谁？它们又发挥着怎样的生物学功能？
近日，高珊教授课题组在PNAS杂志发表题为“A distinct subclade of AlkB family demethylases in ciliates safeguards the positional fidelity of eukaryotic N6-methyladenine (6mA)”（纤毛虫独特的AlkB家族去甲基化酶维持6mA的准确定位）的研究成果，为这个谜题提供了答案。该研究在单细胞模式生物——嗜热四膜虫中，鉴定并解码了首个6mA去甲基化酶DMT3的作用机制，揭示了其与多细胞生物同源蛋白不同的催化特性，以及其在调控基因表达、保障有性生殖启动过程中的关键作用。
在本研究中，团队首先通过系统发育分析，在嗜热四膜虫中找到一个AlkB家族ALKBH5分支的同源蛋白DMT3（图1A），并通过一系列遗传学和分子生物学实验证实了它的身份：DMT3敲除导致全基因组6mA水平显著升高约20%（图1B），伴随大量异常甲基化位点的出现（图1C），并导致6mA去甲基化中间产物6hmA的水平显著降低（图1D）；将AlkB家族保守的Fe2+离子和α-酮戊二酸结合基序突变的DMT3回补至DMT3敲除株系后，6mA水平无法恢复（图1E）。这一系列证据证明，DMT3是一个关键的6mA去甲基化酶。
图1. DMT3是6mA去甲基化酶。（A）DMT1-6具有AlkB家族的保守结构域；（B）DMT3敲除株系整体6mA水平显著上升；（C）DMT3敲除株系中部分腺嘌呤位点的6mA水平显著上升；（D）DMT3敲除株系的6hmA水平显著下降；（E）野生型DMT3回补使6mA水平恢复，而突变DMT3回补则不能使6mA水平恢复。
与多细胞真核生物中主要作用于单链RNA m6A修饰的ALKBH5同源蛋白不同，DMT3特异性地靶向双链DNA上的对称ApT基序，并且能作用于全甲基化和半甲基化状态的6mApT位点（图2A-C）。研究进一步发现，DMT3对双链DNA的偏好性可能源于其催化结构域中一个关键的天然氨基酸替换（半胱氨酸到丝氨酸），该氨基酸替换在整个纤毛虫谱系中普遍存在（图2D）。将该位点反向突变为半胱氨酸会显著削弱其对双链DNA 6mA的去甲基化能力（图2E）。
图2. DMT3作用于全甲基化和半甲基化的6mApT。（A）野生型和DMT3敲除株系的6mApT都主要是全甲基化状态；（B）AMT1敲除和AMT1、DMT3双敲除株系的6mApT都主要是半甲基化状态；（C）在野生型（全甲基化位点为主）和AMT1敲除（半甲基化状态为主）株系中过表达DMT3都能使6mA水平显著下降；（D）与多细胞动物ALKBH5同源蛋白相比，纤毛虫ALKBH5同源蛋白的Flip3区域存在天然的半胱氨酸到丝氨酸的替换；（E）DMT3-S1775C过表达不能使6mA显著下降，DMT3-S1775C突变使6mA显著上升。
在野生型细胞中，AMT1甲基转移酶复合体主要负责在转录起始位点（TSS）下游的基因区添加6mA，而DMT3则特异性地驻留在TSS区域，清除被AMT1错误添加到该区域的6mA。当DMT3缺失后，TSS区域会出现大量异常累积的6mA（图3A，B）。
图3. DMT3去除AMT1在TSS处添加的6mA。（A）6mA、DMT3、AMT1复合体以及核小体的基因组分布特征；（B）代表性基因座的6mA、DMT3、AMT1复合体以及核小体分布特征。
与此同时，DMT3敲除株系的有性生殖（接合生殖）启动严重受阻（图4A，B）。分析发现，细胞配对所必需的MTA6、MTB6和CDK19基因的TSS区域出现异常6mA，并伴随局部染色质开放性下降和转录沉默（图4C）。而通过同时敲除甲基转移酶编码基因AMT1消除TSS区域的异常6mA后，接合生殖缺陷的表型被成功拯救（图3A，3B，4A）。这一结果清晰地表明，DMT3介导的6mA去甲基化，通过清除关键基因TSS区域的6mA“噪音”以维持正常转录，从而保障接合生殖正常启动。
图4. DMT3参与调控四膜虫接合生殖启动。（A）DMT3敲除阻碍接合生殖启动，而AMT1与DMT3双敲除则又可以使这种接合生殖缺陷恢复；（B）各个株系配对组合的接合生殖启动效率统计；（C）MTA6、MTB6和CDK19基因座的6mA、转录以及染色质开放性状态。
综上所述，本研究在单细胞真核生物嗜热四膜虫中，首次鉴定出AlkB家族的6mA去甲基化酶DMT3，并揭示了其区别于多细胞生物同源蛋白的独特催化特性。研究提出的工作模型（图5）描绘了细胞如何利用AMT1（书写器）和DMT3（橡皮擦）在TSS区域构建“动态平衡”，从而确保6mA修饰的精准定位。这一发现不仅为单细胞真核生物的6mA去甲基化酶研究补上了关键一环，也为理解DNA修饰的位置准确性提供了重要切入点。
与此同时，本研究的发现也为系统性比较真核生物中两种主要的DNA甲基化修饰6mA与5-甲基胞嘧啶（5mC）提供了新的维度。传统观点认为，多细胞真核生物的5mC与单细胞真核生物的6mA功能相反：5mC与转录抑制相关，而6mA则与转录激活关联。然而，越来越多证据表明，启动子区域的5mC抑制转录，而基因内部的5mC常与活跃转录相关。单细胞真核生物中的6mA大多富集在TSS下游并发挥转录激活作用，而本研究发现TSS附近的异常6mA则倾向于抑制转录。因此，5mC与6mA或许并非如传统观点所认为的功能对立，而是可能遵循着相似的调控逻辑：DNA甲基化的转录效应取决于其在基因组中的位置。这一认识不仅深化了对6mA功能机制的理解，也为探讨DNA修饰在真核生物演化过程中的功能保守性与分化提供了全新视角。
图5. DMT3表观遗传调控功能模式图。
该研究由中国海洋大学进化所原生动物学团队高珊教授课题组完成。高珊教授课题组博士生牛俊骅和于浩泽为该文章的共同第一作者，高珊教授为文章的通讯作者。高珊教授课题组博士毕业生刘永强，南北，博士生聂兰蘅，云南大学生物医药研究院章文信副教授，中国海洋大学医药学院宋妮老师，中科院分子细胞科学卓越创新中心荣少钦博士，复旦大学生物医学研究院周丹副研究员对该工作亦有重要贡献。
刘永强（第一排左一），于浩泽（第一排左四），牛俊骅（第一排右一），南北（第二排左二），聂兰蘅（第二排右一）。
原文链接：
www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2526398123
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