2024年3月12日，海洋生物多样性与进化研究所原生动物学团队在著名生物学期刊Genome Research发表研究成果“Dynamic DNA N6-adenine methylation (6mA) governs the encystment process, showcased in the unicellular eukaryote Pseudocohnilembus persalinus”。该论文以可诱导形成包囊的盾纤类纤毛虫Pseudocohnilembus persalinus（水滴伪康纤虫）为材料，探究了DNA N6-腺嘌呤甲基化（6mA）在真核生物营养体和包囊两种状态间的动态变化，并揭示了6mA在包囊形成过程中调节基因表达的潜在作用机制。
形成休眠包囊是单细胞真核生物应对外界环境变化的一种生存策略，涉及复杂且高度调控的生理和生化变化。现有研究多集中在包囊的形态和结构变化上，但调控这一过程的分子机制仍不明确。近期研究表明，DNA N6-甲基腺嘌呤（6mA）可在外部环境刺激下产生动态变化，并参与下游的压力应激响应。因此，该研究以6mA为切入点，研究了其调控包囊形成的分子机制。
该研究通过饥饿诱导水滴伪康纤虫的营养体形成包囊，对营养体和包囊分别进行免疫荧光染色、DNA点杂交以及超高效液相色谱串联质谱分析，发现包囊中的6mA水平较营养体显著降低（图1）。
图1. 包囊中的6mA水平低于营养体。（A）显微照片。（B）6mA免疫荧光染色。（C）6mA点杂交。（D）6mA小分子质谱。
随后利用单分子实时测序（SMRT）绘制了单碱基分辨率的6mA图谱，发现水滴伪康纤虫中的6mA修饰主要位于ApT基序中，符合单细胞真核生物6mA的普遍特征。分析显示，包囊中6mA的整体水平降低，并出现了分布模式的明显变化：营养体中大量的对称6mA转化为包囊中的非对称6mA（图2）。进一步分析表明，6mA与转录水平呈现正相关，包囊中存在大量6mA水平和转录水平共同下调的基因，且这些基因参与纤毛形成、核糖体代谢、细胞周期调控等包囊形成的关键事件。因此，6mA可能作为转录活跃的标记，通过其水平和模式的动态变化，参与调控包囊形成相关基因的表达（图2）。
图2. 单分子实时测序和转录组测序结果揭示6mA含量和模式的变化以及6mA参与转录调控。（A）包囊的6mA含量降低。（B）6mA由营养体的对称模式变为包囊的非对称。（C）包囊非对称分布6mA位点主要来自于营养体中的对称分布6mA。（D）营养体与包囊中含6mA的基因转录水平更高。（E）共下调基因参与多个包囊形成相关通路。
该研究还鉴定了水滴伪康纤虫中主要的6mA甲基转移酶PpAMT1，发现PpAMT1的表达水平在包囊中显著降低。更为重要的是，通过RNA干扰手段敲降PpAMT1后，细胞形成包囊的速度明显加快，进一步证明了6mA参与调控水滴伪康纤虫包囊的形成（图3）。
图3. 6mA甲基转移酶敲降加速了包囊形成。（A）PpAMT1敲降和表型统计的工作流程。（B）PpAMT1敲降后水滴伪康纤虫形成包囊的进程加快。
基于以上结果，该研究提出了一个由6mA作为分子开关调控包囊的模型：当营养体受到外界环境压力后，维持性6mA甲基化的减弱和潜在的主动去甲基化导致6mA水平下降，以及对称6mA向非对称6mA转化，并使得部分包囊关键基因表达被沉默，最终促进包囊形成；而当包囊接触到适宜的环境条件后，维持性和从头甲基化的增强导致6mA水平和对称模式恢复，部分关键基因表达被启动，最终细胞脱包囊（图4）。该研究对水滴伪康纤虫营养体和包囊的全基因组6mA分布进行了详细的描述，并揭示了6mA在环境压力下参与基因调控的潜在功能，为从6mA修饰的角度理解真核生物对环境信号的响应提供了重要信息。
图4. 6mA调控的成包囊-脱包囊循环模型
进化所博士后刘永强博士、博士研究生牛俊骅和叶飞为该文章的共同第一作者，高珊教授为文章的通讯作者。日本庆应大学Therese Solberg博士、进化所毕业生卢博荣博士、山东大学王春荻副研究员以及瑞士伯尔尼大学Mariusz Nowacki教授对本文亦有重要贡献。该项工作得到了国家自然科学基金杰青项目、崂山实验室科技创新项目、中国博士后科学基金、世界顶级科学研究中心计划等项目经费资助。
文章链接：
https://genome.cshlp.org/content/early/2024/03/12/gr.278796.123
