表观遗传修饰的“从头建立”在基因表达调控、基因组稳定性维持和细胞分化等过程中发挥着关键作用[1-5]。在单细胞真核生物嗜热四膜虫（Tetrahymena thermophila）的接合生殖过程中，发育中的新大核会经历广泛的表观遗传重编程（图1）[6-12]。这一过程为研究表观修饰的从头建立机制提供了理想的模型。
图1. 在四膜虫接合生殖过程中，表观遗传修饰在发育时期的新大核中从头建立。（A）四膜虫的营养生殖及接合生殖过程示意图；（B-C）接合生殖第10和24时的细胞形态及核型；（D）组蛋白甲基化H3K4me3和DNA甲基化6mA在发育时期的新大核中从头建立。
然而，在接合生殖时期，发育中的新大核、亲代大核与小核在同一细胞内共存（图1），这一复杂核型严重阻碍了对新大核进行基因组及表观组学的高分辨率分析[11]。获取高纯度新大核对后续研究尤为必要，但以往纯化方法存在耗时长、依赖特殊装置或细胞发育不同步时分选效率低等局限[13-14]。
针对该瓶颈，进化所原生动物学团队建立了结合差速离心与流式分选的“两步法”纯化策略（图2）：首先通过差速离心初步富集，将新大核比例提升至65%以上（图3A）；随后以此为材料，利用流式细胞仪根据细胞核大小及荧光强度精确分离，最终使新大核纯度达到99%以上（图3B）。
图2. 新大核纯化流程：收集并破碎接合生殖时期的四膜虫细胞后，通过差速离心对新大核进行初步富集，富集产物通过流式分选进一步纯化。
此外，为了评估该纯化方法的可靠性及纯化产物的质量，团队通过H3K4me3（小核中缺失）免疫荧光染色有效排除了小核污染[15]（图3C）；利用跨IES序列PCR证实纯化产物中无亲代大核污染[16-17]（图3D）；MNase酶切实验结果显示分选产物保留了典型的核小体DNA ladder特征，表明其染色质结构保持完整（图3E）。
图3. 新大核的纯化与验证。（A）当离心力为3,500-4,500 g（F3和F4）时，新大核在离心产物中初步富集；（B）经过流式分选后，纯化产物中新大核的比例超过99%；（C）免疫荧光染色结果显示，分选样品中无小核污染；（D）跨IES序列的PCR扩增结果显示，分选样品中无亲代大核污染；（E）MNase酶切实验验证了分选样品的染色质结构完整性。
该研究所建立的高效纯化方法，有效克服了发育非同步性带来的挑战，不仅为四膜虫新大核的分离提供了优化方案，其策略也为其他多核或复杂核型系统的分离提供了参考。高质量的新大核样本，也为后续应用CUT&Tag、染色质免疫共沉淀（ChIP）及三代测序等技术进行的研究提供了理想的实验材料[18]。
该研究由进化所原生动物学团队高珊教授课题组完成。高珊教授课题组博士毕业生程婷（现为陕西师范大学湿地原生动物多样性与进化研究室讲师）和张佳晨为该文章的共同第一作者，高珊教授和日本基础生物学研究所Kensuke Kataoka副研究员为文章的通讯作者。进化所在读博士生刁静涵和李海程对本文亦有重要贡献。
文章链接：
https://doi.org/10.1093/cz/zoag032
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